Domaines scientifiques
Mots-clés
ITMO
Clément MEILLER Ingénieur d'études
Parcours et situation actuelle
FORMATION
2009-2010
Master II de Génétique mention Bien / Magistère Européen de Génétique (Université Paris VII Denis Diderot)
Enseignements: Biothérapie, Génétique des cancers, Génétique épidémiologique des maladies multifactorielles, Génétique humaine et neurobiologie, Génétique et épigénétique des maladies multifactorielles, Génétique et physiologie de la reproduction, Génétique moléculaire des prédispositions aux cancers, Génomique, Génétique cellulaire
2007-2008
Licence de Génétique mention Bien (Université Paris VII Denis Diderot)
Enseignements: Biologie moléculaire, Génétique humaine, Biostatistiques, Génétique des Eucaryotes et des Procaryotes, Biologie cellulaire, Immunologie, Virologie, Microbiologie, Bioéthique
EXPERIENCES PROFESSIONNELLES
Depuis 2012
Ingénieur d’études dans l’équipe du Dr Jessica ZUCMAN-ROSSI
Génétique fonctionnelle des tumeurs solides, INSERM UMR1162
Institut de Génétique Moléculaire, Paris
Caractérisation moléculaire des carcinomes hépatocellulaires et analyse fonctionnelle
2010-2012
Ingénieur d’études dans l’équipe du Dr Christian NERI
Biologie et pathologie du neurone, INSERM U894
Hôpital Ste Anne, Paris
Mécanismes neuroprotecteurs du Lithium dans la maladie de Huntington
2010
Stage de 6 mois dans l’équipe du Dr Agnès ROTIG
Génétique des maladies mitochondriales, INSERM U781
Hôpital Necker, Paris
Régulation des gènes de la voie de synthèse de l’ubiquinone chez l’Homme
2009
Stage de 5 mois dans l’équipe du Dr Andrea CALIFANO
Génétique des cancers
Columbia University Medical Center (New York)
Régulation des facteurs de transcription STAT3 et CEBPb dans les Glioblastomes
2008
Stage de 3 mois dans l’équipe du Dr Fanni GERGELY
Biologie du centrosome
Cancer Research UK, Cambridge Research Institute
Polarisation du centrosome et cancers
Résumé scientifique
J’ai réalisé un stage de 3 mois en 2008, dans le cadre de l’obtention de ma Licence en Génétique, au sein de l’institut de Cambridge du Cancer Research UK dans l’équipe du Dr Gergely. Cette première expérience, encadré principalement par une doctorante du laboratoire, m’a enseigné l’importance des bonnes pratiques de laboratoire ainsi que du travail bibliographique que nécessite l’élaboration et le développement d’un projet de recherche. L’objectif du laboratoire était de mieux comprendre les bases moléculaires des fonctions du centrosome dans la division cellulaire et l’organisation tissulaire. Mon projet avait pour but d’étudier le rôle de la protéine centrosomale CEP152 dans la polarisation du centrosome, centre organisateur des microtubules, responsable du développement du cil primaire dans les cellules épithéliales rénales, antenne sensorielle impliquée dans la signalisation cellulaire et dont la perturbation peut conduire à des cancers. J’ai pu suivre, puis réaliser, différentes techniques de biologies cellulaires et moléculaires telles que la manipulation de lignées cellulaires (Jurkat, Raji, Hela), l’utilisation de l’ARN interférent pour moduler l’expression de gènes cibles (clonage, transfection de plasmides et transduction de shRNA), l’étude de l’expression des gènes au niveau transcriptionnel (extraction d’ARN et PCR quantitative) et protéique (extraction protéique et western blot). D’autre part, j’ai pu me familiariser avec les techniques de marquage cellulaire (immunohistochimie) et de microscopie confocale pour évaluer la polarisation du centrosome des cellules traitées. J’ai ainsi pu montrer qu’une extinction de l’ordre de 70% du gène CEP152 (PCR quantitative) conduisait à un taux de centrosomes polarisés dans le modèle d’une synapse immunologique égal à 20% contre 80% chez le control (vecteur vide sans shRNA).
J’ai poursuivi sur la thématique de la recherche contre le cancer puisque j’ai rejoins l’équipe du Dr Califano au Columbia Medical Center à New York, à l’occasion de mon stage de fin de M1 de 5 mois en 2009. L’équipe qui regroupe des biologistes, bioinformaticiens et biostatisticiens, travaille sur la prédiction et l’identification de gènes régulateurs majeurs (modules de régulation) responsables de la signature spécifique d’une tumeur. Mon projet, au sein de l’équipe de biologistes composée de 3 post doctorants et un ingénieur, consistait à valider la signature prédite par des approches bioinformatiques développées au laboratoire, de 20 gènes modulateurs et de 13 gènes cibles de deux facteurs de transcription STAT3 et CEBPb nécessaires et suffisants à la transformation mésenchymateuse des glioblastomes, tumeur cérébrale particulièrement agressive chez l’Homme. L’idée étant par la suite d’identifier des drogues spécifiques de ces gènes susceptibles de moduler l’activité de STAT3 et CEBPb et par conséquence réduire l’agressivité tumorale. J’ai ainsi pu gérer pour la première fois un projet de manière autonome mais en profitant des diverses compétences de l’équipe pour me soutenir scientifiquement et techniquement. Après avoir évalué la cinétique d’extinction de siRNA STAT3 et CEBPb dans la lignée cellulaire humaine de glioblastome SNB19 par PCR quantitative (sybr green) et western blot, j’ai réalisé un profil d’expression par PCR quantitative d’un panel de 13 gènes prédits comme cibles potentielles de ces deux facteurs de transcription ce qui a permis de sélectionner 8 gènes rapporteurs de l’activité de STAT3 et CEBPb parmi les 13 gènes cibles prédits. Concernant les 20 modulateurs putatifs, j’ai dans un premier temps vérifié leur expression dans les SNB19 par PCR quantitative, puis j’ai criblé différents siRNA pour les gènes pour lesquels il n’y avait pas eu de validation de l’efficacité de l’extinction dans la littérature. Ce travail a permis au laboratoire de disposer d’un panel de gènes cibles formant une signature spécifique de l’activité de STAT3 et CEBPb et d’une collection de siRNA efficaces pour trouver les modulateurs majeurs de l’activité des facteurs de transcription STAT3 et CEBPb et tester des inhibiteurs si ils existent.
Pour diversifier mes expériences, j’ai choisi de faire mon stage de M2 (en 2010) d’une durée de 6 mois dans le laboratoire du Dr Rötig à l’hôpital Necker (Paris) au sein de l’unité INSERM U781, qui s’intéresse à la génétique des maladies mitochondriales. Là encore j’ai pu profiter d’un environnement de travail très enrichissant avec une directrice très disponible, une enseignante chercheuse, deux doctorants et une assistante ingénieur. Mon projet portait sur la régulation des gènes de la voie de synthèse de l’ubiquinone chez l’Homme. Grâce à cette expérience, j’ai appris la technique de séquençage Sanger (ABI 3130XL) et l’analyse de séquences (seqscape) pour rechercher des mutations dans les gènes candidats impliqués dans la voie de synthèse de l’ubiquinone chez de nouveaux patients. D’autre part, ce stage a été l’occasion de mettre en place une nouvelle technique pour ce laboratoire, à savoir la PCR quantitative, qui n’avait pas été utilisée jusqu’à présent au sein de l’équipe. Sur la base de mon précédent stage, de communications avec d’autres équipes et de recherches bibliographiques, j’ai donc pris en charge l’élaboration des protocoles et la mise au point des expériences, notamment le design et la validation des primers (spécificité) qui est une étape critique puisque nous utilisions la chimie sybr green. J’ai réalisé les profils d’expression des gènes de synthèse de l’ubiquinone chez des patients atteints de déficits primaires en ubiquinone afin d’identifier des mécanismes de compensation génétique rendant compte de l’hétérogénéité clinique observée chez ces patients. Ce travail a impliqué de designer et valider les oligonucléotides, d’extraire les ARN à partir de cellules (fibroblastes de patients en culture) ou de tissus congelés, de les transcrire en ADNc, puis de réaliser des PCR quantitatives pour les 16 différents gènes de la voie dans les différents échantillons. J’ai ainsi montré une surexpression massive du gène CABC1 chez tous les patients ce qui a conduit a de nouvelles perspectives à savoir est ce que cette régulation est spécifique des déficits en ubiquinone et j’ai pu montrer que CABC1 était surexprimé (PCR quantitative) chez des patients atteints de déficits de la chaîne respiratoire autres que l’ubiquinone. J’ai achevé mon stage en travaillant sur la mise au point de conditions de culture pour traiter les fibroblastes à l’ubiquinone afin de tester la sensibilité de cette régulation à l’ubiquinone.
Suite à cette première expérience concluante en génétique humaine et à l’obtention du diplôme de Magistère Européen de Génétique, j’ai rejoins le laboratoire du Dr Néri intitulé « Biologie et pathologie du neurone » à l’hôpital St Anne (Paris) dans le cadre d’un CDD d’ingénieur d’études dans l’unité INSERM U894. L’équipe était composée d’un bioinformaticien, d’un biostatisticien et de biologistes dont deux post doctorants et 3 ingénieurs d’études. J’ai dans un premier temps été recruté dans le cadre d’un financement AFM (8 mois) pour réaliser un crible en aveugle de chimiothèques sur un modèle C.elegans de dystrophie musculaire (OPMD). L’idée était de mettre en place un protocole standardisé pour cribler une large collection de drogues afin d’identifier celles qui restauraient le phénotype de dystrophie musculaire observé chez le nématode. J’ai donc défini les conditions de culture et de traitement des nématodes (synchronisation, comptage des larves, culture liquide en plaque 96 puits, traitement 3 jours après éclosion pendant 5 jours, immobilisation, lecture de la fluorescence sur le plate Runner HD de Trophos pour détecter les cellules musculaires marquées par fluorescence). Ces travaux ont permis d’identifier un panel de 12 drogues parmi plus de 700 testées, significativement efficaces pour le sauvetage phénotypique.
A la fin de ce contrat, j’ai pu prendre en charge un nouveau projet au sein du laboratoire dans le cadre d’un financement OSEO d’un an, qui portait sur les mécanismes d’action du lithium dans la maladie de Huntington. A cette occasion, j’ai eu recours à différentes techniques de biologies cellulaires et moléculaires comme la manipulation de lignées cellulaires (cellules striatales de souris), l’utilisation de l’ARN interférent pour moduler l’expression de gènes cibles (clonage, transfection de plasmides et de siRNA par des agents de transfection de type JetpPEI et JetSI ou par électroporation de type AMAXA), et l’étude de l’expression des gènes au niveau transcriptionnel (extraction d’ARN et PCR quantitative, test luciférase) et protéique (extraction protéique et western blot).
D’autre part, j’ai introduit un nouveau protocole de test de mortalité cellulaire au sein du laboratoire basé sur la déprivation sérique (24h) ou le traitement à l’arsenite de sodium (6h) pour induire la mort, puis la détection repose sur le clivage de la caspase3.
J’ai pu en outre développer des compétences originales sur C.élégans en travaillant sur des modèles de nématodes de la maladie de Huntington notamment par des expériences de réponse au toucher, de production de lignées (mutagénèse par UV, PCR sur un ver, croisement et entretien des lignées) ou encore d’imagerie pour évaluer la dystrophie axonale.
Ces travaux ont donné lieu à un rapport d’activité dans lequel j’ai pu montrer que le citrate de lithium réduit significativement la mortalité cellulaire. L’action du citrate de lithium semble passer par la régulation de l’autophagie (western blot de LC3 dans des cellules mutées ou non, traitées ou non au lithium) et de certaines voies de signalisation (stimulation de la voie Wnt et Akt : diminution de l’activité transcriptionnelle du promoteur de FOXO3A établie par test dual-luciférase, baisse de la phosphorylation de la beta catenin en réponse à l’action inhibitrice du lithium sur GSK3b établie par western blot). Les résultats in vivo confirment l’action neuroprotectrice du lithium que ce soit au niveau de l’effet dose du lithium sur la réponse au toucher (10 touches par animaux, 50 animaux par conditions, 7 concentrations de lithium, 2 modèles de nématodes) ou de la quantification de la dystrophie axonale par microscopie à fluorescence. Les expériences de réponse au toucher dans les lignées de nématodes croisées avec d’autres fonds génétiques ont aussi confirmé l’implication des voies Wnt et Akt (perte du sauvetage phénotypique du traitement au lithium chez des doubles mutants notamment huntingtin/TCF et huntingtin/FOXO)
Depuis juin 2012, je me suis replacé dans la thématique de la recherche sur le cancer en intégrant comme ingénieur d’études l’unité INSERM UMR1162 du Dr Zucman Rossi intitulée « Génomique fonctionnelle des tumeurs solides » à l’Institut de Génétique Moléculaire (Paris). Il s’agit d’une équipe d’une trentaine de personnes réparties sur des axes de recherches variés (tumeurs hépatiques, rénales, mésothéliales et méningées). En ce qui me concerne, je travaille sur la caractérisation moléculaire des carcinomes hépatocellulaires (CHC).
Dans ce contexte, Je me suis consacré à :
- 1. Le développement de nouvelles technologies d’analyse moléculaire
J’ai la chance d’avoir en charge la mise au point et l’optimisation de nombreux protocoles pour faire fonctionner des technologies de pointe en génomique et analyser au mieux les résultats qui en sont issus tout en minimisant les coûts. Dans le cadre de cette mission, j’ai ainsi développé un protocole de préparation de librairie pour le séquençage nouvelle génération (miSeq d’Illumina) basé sur un enrichissement par PCR en y associant une autre technologie développée par Fluidigm permettant de réduire considérablement le niveau de multiplexage des primers et ainsi obtenir une couverture de 98% du panel de gènes cibles avec une profondeur ≥ 50X malgré de nombreuses régions riches en GC difficiles à amplifier. J’ai formé de nouveaux utilisateurs pour que cette technologie soit utilisée en routine et sur d’autres types de tumeurs comme par exemple les mésothéliomes. En outre j’ai beaucoup collaboré avec Sandrine Imbeaud (biostatisticienne et bioinformaticienne dans l’unité INSERM UMR1162) pour développer des solutions automatisées de design de primers et d’analyse des résultats via des scripts R ou Linux (détection et annotation des variants, contrôle qualité de la couverture par échantillon).
D’autre part, j’ai développé un protocole de génotypage haut débit sur le Biomark (Fluidigm) qui m’as permis de génotyper 96 SNPs sur une cohorte de plus de 2000 CHC pour une collaboration avec l’hôpital Jean Verdier dans le cadre d’une étude d’association. J’ai aussi mis en place un protocole de PCR quantitative sur cet instrument qui a conduit à analyser l’expression de 4 panels de 96 gènes sur plus de 1500 CHC. J’ai formé de nouveaux utilisateurs sur cette technologie aboutissant au criblage de mésothéliomes et de cancers du rein pour des panels de gènes adaptés. Enfin, j’ai travaillé sur le transfert de signatures transcriptomiques utilisées pour la classification moléculaire des tumeurs hépatiques qui avaient été développées sur des échantillons extraits à partir de tissus congelés par PCR quantitative (sondes Taqman) afin de les appliquer à des échantillons extraits de blocs paraffine (FFPE). J’ai ainsi pu établir que la technologie développée par Nanostring qui repose sur une détection directe des ARNm par hybridation de sondes offrait de meilleurs résultats que la PCR quantitative sur ce type d’échantillon pour notre panel de gènes cibles ce qui a fait l’objet d’un poster et d’un abstract pour le 5ème congrès sur la Génomique fonctionnelle du foie au Centre de recherche Les Cordeliers à Paris en mars 2014.
- 2. la validation et l’optimisation de l’analyse des résultats d’exomes.
J’ai vérifié par séquençage selon la méthode Sanger (ABI3500XL) les variants identifiés par séquençage haut débit (exome) pour une partie des échantillons soit environ 500 variants. Puis j’ai observé la concordance avec les prévisions de validation réalisées en utilisant Integrative Genomic Viewer (IGV, Broad Institute). J’ai ainsi pu déterminer des seuils (de couverture et de nombre de reads mutés) permettant d’identifier avec précision (taux de faux positifs de 2%) la plupart des variants somatiques et germinaux.
Ainsi j’ai mis en place une méthode d’analyse fiable (confiance de 98%), rapide et économique (95% des variants en moins à valider en séquençage Sanger) utilisée désormais en routine au sein du laboratoire pour l’analyse des résultats d’exomes.
- 3. L’analyse fonctionnelle à partir des résultats d’exomes
Les études d’exomes dans les CHC ont montré une récurrence de variants somatiques prédits malins (polyphen-2) dans les gènes KEAP1 et NFE2L2 appartenant à la voie de signalisation NRF2, impliquée dans la réponse au stress oxydatif. A partir de données de la littérature, nous avons émis l’hypothèse que l’activation aberrante de cette voie pouvait sensibiliser les cellules tumorales au traitement avec des inhibiteurs d’HSP90. J’ai mené des tests de viabilité (MTT, MTS, comptage cellulaire) sur différentes lignées hépatiques. J’ai génotypé la cible de la voie NRF2 à savoir le gène NQO1 (sondes taqman) pour toutes les lignées et établi son expression par PCR quantitative (ABI7900HT) pour sélectionner mes modèles cellulaires. Je les ai transfectées avec des plasmides produits par mutagénèse dirigée portant les variants identifiés en exome (mutation activatrice de NFE2L2) ou avec des siRNA pour reproduire l’effet de mutations inactivatrices de KEAP1. Puis je les ai traitées avec des doses croissantes d’inhibiteurs d’HSP90 pour réaliser des courbes de viabilité en fonction de la gamme de concentration d’inhibiteurs. J’ai ainsi pu montré la corrélation entre l’expression de NQO1 et la sensibilité à deux inhibiteurs d’HSP90 (17-AAG et 17-DMAG).
- 4. La recherche d’altérations génétiques dans les gènes candidats
J’ai participé au séquençage Sanger d’un large panel de carcinomes hépatocellulaires (300) pour des gènes cibles récurrents. J’ai appris à maîtriser des bases de données de génomique et génétique telles que UCSC, Ensembl, Cosmics et Alamut ainsi que les outils d'analyses tels que primer3, Amplify3, RepeatMasker pour designer des amorces. Je maîtrise également l'outil d'analyse BLAST pour l'alignement des séquences et Sequencher analysis pour l'analyse des chromatogrammes.
- 5. La responsabilité de l’activité de séquençage
J’ai pris en charge la mise en place du séquençage haut débit au sein du laboratoire ce qui implique une veille technologique soutenue et de nombreux échanges avec l’extérieur. D’autre part, je suis responsable de la formation des utilisateurs et de la maintenance du parc de séquenceurs (AB3130XL, AB3500XL, miSeq) tout comme de la gestion du stock de produits en lien avec cette activité. Cela nécessite un bon sens relationnel pour établir les devis, effectuer les demandes d’offres annuelles ou de remises, et permet d’être en contact avec les différents revendeurs pour connaître les produits disponibles, optimiser les protocoles et améliorer ainsi les résultats.
- 6. La gestion de la tumorothèque
La collection de tumeurs du laboratoire contient environ 3000 tissus humains congelés à -80°C. Je participe à la gestion des tissus (archivage: lieux de stockage, étiquetage, quantité de tissus restante) pour lesquels nous réalisons une extraction systématique des acides nucléiques constituant ainsi la DNAthèque et la RNAthèque. Après extraction, j'effectue les contrôles quantitatif (Nanodrop et Fluorimètre) et qualitatif (migration électrophorétique sur gel). Ces nouvelles données obtenues sont archivées dans une base de donnée permettant ainsi la transmission des informations concernant chacun des tissus. D’autre part, j’ai coordonné et développé les protocoles pour mettre en place l’extraction d’ADN et d’ARN à partir de tissus fixés et inclus en paraffine (FFPE) en collaborant avec des anatomopathologistes ce qui a conduit à la mise en place d’une collection de plus de 200 tumeurs supplémentaires et m’a permis de mettre au point différentes technologies d’analyse génomique comme Fluidigm ou Nanostring sur ce type échantillons.
- 7. La formation et l’encadrement des étudiants et techniciens
J’assure au laboratoire la formation et l’encadrement technique de nouveaux arrivants. Je forme actuellement Yoann Martin dans le cadre de son arrivée au laboratoire comme ingénieur d’étude sur les carcinomes hépatocellulaires et Lisa Quetel dans le cadre de son stage de M2 sur les mésothéliomes pour leur transmettre les bonnes pratiques de laboratoire et les guider dans la réalisation de leurs projets de recherche. J’assure également l’encadrement de Carole Zober (technicienne de laboratoire) et plus généralement la formation des nouveaux utilisateurs sur les nouvelles technologies que j’ai mises en place dans le laboratoire (séquençage nouvelle génération, génotypage haut débit, PCR quantitative haut débit, analyse d’expression par détection directe sur ARNm) ainsi que sur des techniques que je maîtrise (séquençage Sanger, PCR quantitative, western blots, culture cellulaire).
Ainsi j’ai pu me former et apprécier le travail d’ingénieur au sein de différents laboratoires INSERM au cours de ces 6 dernières années.
